活細(xì)胞骨架染色--對比LifeAct-GFP和actin-GFP在活細(xì)胞骨架染色中的應(yīng)用
Actin-肌動蛋白是細(xì)胞骨架不可或缺的一個組成部分，其在很多基礎(chǔ)的細(xì)胞活動中扮演著非常重要的角色。尤其在細(xì)胞形態(tài)，遷移和研究細(xì)胞機制中，肌動蛋白都是一個非常理想的觀測蛋白。肌動蛋白是由小球狀的G-actin聚合成絲狀的F-actin動態(tài)交互變化構(gòu)成的，從而參與了細(xì)胞活動中的各種細(xì)胞骨架的變化。通常研究活細(xì)胞中actin的活動用的是轉(zhuǎn)染actin-GFP融合蛋白的質(zhì)粒，可以同時標(biāo)記F-actin和G-actin，可以有效的反映出細(xì)胞骨架的相對活性，但是當(dāng)值需要觀測F-actin的時候，使用actin-GFP會降低信噪比，難以專一捕捉F-actin的活動。更有研究顯示，使用actin-GFP會直接影響細(xì)胞遷移和細(xì)胞分裂中的肌動蛋白活性。
2015年英國的科研人員研究了幾種可以標(biāo)記F-actin染料發(fā)現(xiàn)LifeAct是一種觀測F-actin非常理想的染料，其能特異性結(jié)合F-actin而不會影響肌動蛋白的活性，能夠很好的顯現(xiàn)出肌動蛋白的結(jié)構(gòu)。LifeAct是一個17個氨基酸形成短肽，由于其很小，不會被哺乳動物細(xì)胞當(dāng)作外來蛋白清除，從而使一個非常理想的F-actin標(biāo)記物。文中，以人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs， Human mesenchymal stem cells）為載體，研究LifeAct-GFP對比actin-GFP在觀測肌動蛋白中的應(yīng)用。
Differential effects of LifeAct-GFP and actin-GFP on cell mechanics assessed using micropipette aspiration
K. Sliogeryte, S. Thorpe, Z. Wang, C. Thompson, N. Gavara and M. Knight
Journal of Biomechanics, 2015, 10.1016/j.jbiomech.2015.12.034
（一）實驗材料
1) 細(xì)胞: hMSCs （STEMCELL Technologies，UK）
2) 試劑: LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒 （ibidi， Germany）
DMEM （Gibco）
Actin-GFP
Lipofetamine LTX Plus (Invitrogen)
4%多聚甲醛溶液
0.5%Triton X-100
3) 耗材：玻璃管（外徑1mm，內(nèi)徑0.58mm）
（二）實驗步驟
1、LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染
l 使用未分化的hMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染actin-GFP質(zhì)粒。
l 無抗生素10%FBS低葡萄糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞30min到1h
l 使用Lipofetamine LTX Plus轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，按照說明書將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時。
l 使用未分化的hMSCs細(xì)胞和，hMSCs細(xì)胞分化的永生化軟骨細(xì)胞系感染含LifeAct-TagGFP2的腺病毒。
2、固定細(xì)胞的肌動蛋白結(jié)構(gòu)
使用Alexa Flour555-phalloidin標(biāo)記F-actin
l 單層細(xì)胞貼壁染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
l 懸浮細(xì)胞染色，是將已經(jīng)用LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化為單細(xì)胞，再在懸浮液中直接用4%多聚甲醛固定10分鐘，再用0.5%Triton X-100通透5分鐘，再用Alexa Flour555-phalloidin染色20分鐘。
3、微管吸吮技術(shù)
l 將外徑1mm，內(nèi)徑0.58mm玻璃管拉為內(nèi)徑7-8μm的微管
l 使用注射泵維持微管內(nèi)有0.76kPa的負(fù)壓
l 輕輕吸取細(xì)胞，每2秒采集一張圖片
l 細(xì)胞在微管負(fù)壓情況下會有不規(guī)則的突起，進入微管，能很好的觀測F-actin的活動。
（三）實驗結(jié)果
1、鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染共定位（圖一）
圖一：鬼筆環(huán)肽和LifeAct-GFP和 actin-GFP轉(zhuǎn)染共定位：A、E）貼壁細(xì)胞中，LifeAct-GFP和 Actin-GFP 在標(biāo)記F-actin時都表現(xiàn)很好，但是在懸浮細(xì)胞中，C、G）雖然LifeAct-GFP和 Actin-GFP和鬼筆環(huán)肽都能共定位F-actin，但是actin-GFP在整個細(xì)胞中都有染色，因為其同時染G-actin沒有凸顯出F-actin。
2、微管吸吮技術(shù)使細(xì)胞發(fā)生形變，觀察F-actin活動（圖二）
圖二：微管吸吮技術(shù)造成細(xì)胞形變。A）LifeAct-GFP可以很好的追蹤F-actin，會根據(jù)細(xì)胞的形變，標(biāo)記到細(xì)胞突起的外緣的骨架；B）使用Actin-GFP標(biāo)記沒有特異性，不能看到細(xì)胞變形中邊緣的骨架。
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