環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)--使細(xì)胞侵襲的過(guò)程可視化
腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要特征。為了研究腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程的機(jī)制，一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立起來(lái)，用于研究細(xì)胞侵襲基底膜和基質(zhì)的過(guò)程。體外侵襲實(shí)驗(yàn)首先是采用人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，可以在37℃逐漸凝固成膠，結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。通常的實(shí)驗(yàn)是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel，細(xì)胞不能自由穿過(guò)，必須分泌水解酶，并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)。實(shí)驗(yàn)之后通過(guò)對(duì)穿過(guò)“基質(zhì)膜”的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)確定細(xì)胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細(xì)胞在生理狀態(tài)下的侵襲過(guò)程，但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性，使得直接觀察細(xì)胞偽足和骨架變化變得非常困難。
英國(guó)的科研人員改進(jìn)了腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了一種環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，使得操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化，并且也能模擬3D侵襲。重要的是，能夠使侵襲過(guò)程中的活細(xì)胞或者是固定的細(xì)胞可視化。借用這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法，研究人員發(fā)現(xiàn)侵襲過(guò)程中主要有蛋白酶參與其中。研究發(fā)現(xiàn)，在3D侵襲的細(xì)胞中蛋白酶會(huì)聚集在偽足和細(xì)胞的粘附點(diǎn)上。
Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay
X. Yu and L. M. Machesky
PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605
（一）實(shí)驗(yàn)材料
1) 細(xì)胞: MDA-MB-231
2) 實(shí)驗(yàn)耗材: 傷口愈合插件 （ibidi，80209）
玻璃底培養(yǎng)皿 （ibidi，81158）
3) 試劑: Matrigel （BD）
4%多聚甲醛溶液
0.1%Triton X-100
（二）實(shí)驗(yàn)步驟
l 將ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養(yǎng)皿中間
l 在插件外部鋪 6 × 105 MDA-MB-231細(xì)胞，等待細(xì)胞貼壁
l 細(xì)胞貼壁后移除傷口愈合插件，在細(xì)胞中心形成一個(gè)0.8cm2的空白區(qū)域
l 加入250μl的50% BD Matrigel （4.5mg/ml），將培養(yǎng)皿內(nèi)層剛好鋪滿，能形成一個(gè)0.8mm厚度的“基質(zhì)膜”
l 孵育2小時(shí)，使Matrigel完全固化，加入培養(yǎng)基
l 在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
l 以4%多聚甲醛溶液固定30分鐘，并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色
（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、使用環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴^測(cè)到細(xì)胞侵襲中的活動(dòng)（圖一）
圖一：MDA-MB-231細(xì)胞在環(huán)形細(xì)胞侵襲過(guò)程中形成了侵襲鏈：A）MDA-MB-231細(xì)胞在matrigel中形成了一個(gè)長(zhǎng)的侵襲鏈 B）勤洗臉的免疫熒光圖，紅色為Actin，藍(lán)色為細(xì)胞核
2. 使用環(huán)形侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴涗泴?duì)比侵襲速率和侵襲面積（圖二）
圖二：MDA-MB-231細(xì)胞侵襲過(guò)程受MMP調(diào)控。加入25μM的GM6001能顯著的減緩侵襲速率和侵襲面積。
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