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　　該應(yīng)用描述了一種在流動下的粘附試驗，該試驗旨在研究特定細(xì)胞表面分子的作用，以確定它們在細(xì)胞附著和粘附到其他細(xì)胞類型期間的潛在相互作用。

　　對于我們的方法，我們使用預(yù)染色的鼠腫瘤細(xì)胞（多發(fā)性骨髓瘤：MM）和鼠內(nèi)皮細(xì)胞（EC），然后使用單克隆抗體阻斷我們感興趣的分子之一。簡而言之，將EC接種到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培養(yǎng)24小時。為了開始共培養(yǎng)，將標(biāo)記的MM細(xì)胞添加到流動容器中并繼續(xù)流動。24小時后，用抗體（以阻斷感興趣的分子）或相應(yīng)的同種型對照處理裝置，并保持流動24小時。第二天，將μ-Slides與流體單元(FU)斷開并清洗以去除非粘附的MM細(xì)胞。為了分析標(biāo)記的MM細(xì)胞對EC的粘附，使用共聚焦顯微鏡獲得了μ-Slides的熒光圖像。

　　1. 材料和試劑

　　•MOPC多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞系(ATCC,TIB-23™)

　　•EOMA內(nèi)皮細(xì)胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

　　•含10%FCS的RPMI培養(yǎng)基（FisherScientific，11530586）

　　•內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（EC培養(yǎng)基、CellBiologics、M1168）

　　•PBS（泛生物技術(shù)，P04-361000）

　　•非酶細(xì)胞解離溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

　　•臺盼藍(lán)溶液（Sigma-Aldrich，93595）

　　•CellTracker™綠色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

　　2. 設(shè)備和設(shè)置

　　•帶有2個流體單元(FU)的ibidi泵系統(tǒng)，每個單元都帶有用于2ml儲液罐的支架（ibidi，10977）

　　•ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

　　•ibidiPerfusionSet藍(lán)色，15厘米，內(nèi)徑0.8毫米（ibidi，10961）

　　•ibidi過濾器/儲液罐套裝，2毫升（ibidi，10972）

　　•帶細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的層流罩

　　•培養(yǎng)箱（所有培養(yǎng)步驟均在37°C和5%CO2下進(jìn)行）

　　•帶有適當(dāng)濾光片組和照相機(jī)的熒光顯微鏡

　　•粘度：0.0072(dynxs)/cm²

　　3.實驗流程

　　1.準(zhǔn)備EOMA細(xì)胞稀釋液：根據(jù)制造商的說明，使用非酶細(xì)胞解離溶液分離先前培養(yǎng)的EOMA細(xì)胞。使用血細(xì)胞計數(shù)器（Neubauerchamber）對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。在EC培養(yǎng)基中將細(xì)胞稀釋至1.2x106個細(xì)胞/ml的濃度。

　　2.種入EOMA細(xì)胞：在3個 µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA細(xì)胞稀釋液（每個µ-Slide1.75x105EOMA細(xì)胞），然后孵育3小時。

表1：實驗設(shè)置

　　3.啟動流量：播種三小時后，將2個µ-Slides連接到流體單元FU，使用總量2.7毫升EC培養(yǎng)基。在8.2mbar的壓力下將EOMA細(xì)胞表面的剪切應(yīng)力設(shè)置為0.5dyn/cm²。測量流速并使用兩個FU的平均值來計算校準(zhǔn)因子。提前孵育FU和連接的載玻片過夜。第三個帶有EOMA細(xì)胞的µ-Slide用作靜態(tài)控制。在沒有任何流動的情況下孵育它過夜。

　　4.準(zhǔn)備MM細(xì)胞：根據(jù)制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培養(yǎng)基（不含F(xiàn)CS）中染色6x105MM細(xì)胞。標(biāo)記后，離心細(xì)胞并使用血細(xì)胞計數(shù)器對其進(jìn)行計數(shù)。

　　5.開始與MM細(xì)胞共培養(yǎng)：停止流動并在無菌條件下從FU水庫中取出EC培養(yǎng)基。要開始共培養(yǎng)，將RPMI培養(yǎng)基（含10%FCS）和EC培養(yǎng)基以1:1的比例混合，并填充該混合物總體積為2.5ml，其中含有1.5x105MM注入兩個FU儲液罐。將FU重新連接到泵系統(tǒng)并繼續(xù)流動24小時。

　　6.分子阻斷：將MM細(xì)胞添加到ECs后24小時，用100µg/ml抗體（載玻片 #2）或相應(yīng)的同種型對照（載玻片 #1）處理細(xì)胞，將它們直接添加到FU，無需更換介質(zhì)。將孵育保持在流動狀態(tài)下24小時。

　　7.清洗和成像：從FU上斷開µ-Slides。用PBS清洗細(xì)胞一次，以去除任何非貼壁細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，以可視化附著在EC層上的標(biāo)記MM細(xì)胞。

圖1：與同種型對照處理（左圖）相比，阻斷特定表面分子（右圖）時，MM細(xì)胞對ECs的粘附性降低