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　　1.詳情

　　細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：在匯合的單層中人工產(chǎn)生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞 - 細胞接觸。ibidi Culture-Insert 2 Well為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

　　本應用簡報是使用ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上分析MCF-7細胞遷移實驗的詳細方案。并行測試了五種不同濃度的人表皮生長因子（hEGF）對遷移行為的影響并與對照條件進行比較。

　　2.材料

　　·細胞：MCF-7(ATCC:HTB-22;DSMZ: ACC115)

　　·ibidi實驗耗材：Culture-Insert 2 Well 24, ibiTreat (ibidi, 80242)

　　·細胞培養(yǎng)表面：ibiTreat

　　·細胞培養(yǎng)基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)

　　·細胞解離溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)

　　·生長因子：human epidermal growth factor (hEGF) (Promokine, C-60170)

　　·無菌鑷子

　　·倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細胞成像的頂部培養(yǎng)箱

　　3.實驗工作流程

　　在該實驗中測試了hEGF對MCF-7細胞遷移行為的影響。使用五種不同的hEGF濃度，并將遷移行為與未用hEGF處理的對照細胞進行比較。

　　圖1實驗裝置：測試了五種不同的hEGF濃度（綠色）（5,10,20,30,40ng / ml）。未處理的細胞（白色）作為對照。對每種條件進行四次技術重復。

　　3.1 步驟1：細胞接種

　　正確的接種濃度是一個關鍵參數(shù)，因為24小時后應達到匯合的單層。需要進行預實驗以確定所用細胞系的最佳濃度。

　　1. 取下附在μ-Plate底部的保護膜（圖2A）。

　　2. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將MCF-7細胞懸浮液調(diào)節(jié)至細胞濃度為5×105細胞/ml。

　　3. 將70μl細胞懸浮液應用于2孔的培養(yǎng)插件每個孔中（圖2B）。避免搖動μ-Plate，因為這會導致細胞分布不均勻。

　　4. 將細胞在37°C和5％CO2培養(yǎng)至少24小時。

　　圖2在開始細胞接種步驟（A）之前取下保護膜。將70μl細胞懸浮液填充到2孔培養(yǎng)插件（B）的每個孔中。

　　3.1 步驟2：劃痕形成

　　μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實驗條件可以進行四次技術重復（圖1).

　　1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)24小時后的細胞密度。如果24小時后未達到融合細胞單層，則將μ-Plate于細胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)幾個小時。定期檢查匯合點。

　　2. 將生長因子添加到細胞培養(yǎng)基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。

　　3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養(yǎng)插件。要移除培養(yǎng)插件，請抓住一個角，如圖3所示。

　　4. 用無細胞培養(yǎng)基或PBS洗滌細胞層以除去細胞碎片和未附著的細胞。

　　5. 小心吸出無細胞培養(yǎng)基或PBS。

　　6.用移液管將1ml細胞培養(yǎng)基加到24孔板的每個孔中。

　　圖3使用無菌鑷子取出2孔培養(yǎng)插件

　　3.1 步驟3：獲取顯微鏡圖像

　　我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

　　1. 將μ-Plate 24孔培養(yǎng)板放在顯微鏡上并確定所有24個孔的位置。

　　2. 在接下來的幾個小時內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。在24小時內(nèi)每30分鐘拍攝一次圖像。

　　4.結果

　　分析顯微圖像以獲得關于培養(yǎng)細胞遷移特征信息。分析細胞覆蓋區(qū)域隨時間的變化來確定細胞速度。

　　圖4 hEGF對MCF-7細胞遷移行為影響的比較。測試了四種不同的EGF濃度，并與對照實驗進行了比較。

　　使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上進行測試六種不同（或更多）的條件。通過比較細胞速度與對照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度（每種重復四次）的影響。實驗數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，hEGF增加了MCF-7細胞的細胞速度。如圖4所示，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細胞速度沒有進一步增加。