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　　活細(xì)胞成像是現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)中最引人入勝的技術(shù)之一。它不僅使我們能夠像其他成像方法一樣看到我們細(xì)胞的實(shí)時(shí)快照，而且是我們看到我們的細(xì)胞活動(dòng)的唯一方法。了解它們?nèi)绾我苿?dòng)、遷移，如何交流，如何進(jìn)行細(xì)胞分裂，以及它們?nèi)绾闻判?、分泌、吞噬和進(jìn)食?；罴?xì)胞成像幫助我們了解生物過(guò)程。但與所有方法一樣，在進(jìn)行活細(xì)胞成像時(shí)需要注意一些事項(xiàng)，從細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)到技術(shù)方面，再到分析數(shù)據(jù)的最佳方法。

　　我們用活細(xì)胞成像來(lái)研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞、Schwann細(xì)胞、神經(jīng)元成纖維細(xì)胞）和用于組織重建的各種生物材料之間的相互作用。由于時(shí)間是神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素，我們對(duì)增強(qiáng)Schwann細(xì)胞的遷移潛力尤為感興趣，Schwann細(xì)胞需要快速到達(dá)并橋接損傷部位以引導(dǎo)再生軸突。

　　強(qiáng)烈建議對(duì)細(xì)胞行為和過(guò)程感興趣的每個(gè)人都使用活細(xì)胞成像進(jìn)行研究。以下是我們提供的一些提示，可幫助您從一個(gè)全新的境界來(lái)了解您的細(xì)胞。

　　1、確保您擁有合適的細(xì)胞培養(yǎng)小室

　　首先，您需要確定哪些因素具有視覺(jué)意義。您只是想可視化您的細(xì)胞遷移嗎？或者您是否想研究您的細(xì)胞是否將遷移方向改變?yōu)樘囟ǖ纳L(zhǎng)因子？有多種細(xì)胞培養(yǎng)室可用于活細(xì)胞成像，特別是ibidi提供了各種完全適合您需求的選項(xiàng)。例如， µ-Slide Chemotaxis chambers 細(xì)胞趨化載玻片（圖1）通過(guò)提供允許添加各種因素的細(xì)胞室來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)趨化性測(cè)量。細(xì)胞被接種在兩室的中間，并且可以分析細(xì)胞優(yōu)先地遷移到哪一側(cè)。大多數(shù)情況下，我們使用µ-Slide 4 Well用于我們的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗鼈冚^大的區(qū)域允許在一個(gè)孔中觀察多個(gè)位置。另一種選擇是µ-Slide 4 Well ph+，它有一個(gè)特殊的中間擋板，可實(shí)現(xiàn)相差和高端熒光顯微鏡的出色圖像。有許多不同的腔室可供選用，其中有一些我們還沒(méi)有嘗試過(guò)，但將來(lái)肯定會(huì)嘗試。如果您有使用任何其他腔室載玻片的經(jīng)驗(yàn)以及如何使用它們的，請(qǐng)告知我們！

圖1) ibidi µ-Slide Chemotaxis

　　2、關(guān)于細(xì)胞：周密計(jì)劃您的樣品制備

　　接下來(lái)，重要的是要考慮如何準(zhǔn)備細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞類型、移動(dòng)速度和數(shù)量增長(zhǎng)速度，需要確定各種參數(shù)。例如，Schwann細(xì)胞需要一些時(shí)間來(lái)沉淀，因此在接種后幾小時(shí)開(kāi)始活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)是有意義的。此外，一些細(xì)胞往往會(huì)受到細(xì)胞間接觸的影響，因此重要的是要考慮正確的細(xì)胞播種數(shù)，不同的研究的對(duì)象存在差異。因此考慮不同的細(xì)胞接種數(shù)量是很重要的。最后，決定細(xì)胞是否需要額外的包被也很重要。

　　3、讓您的細(xì)胞在顯微鏡下保持活力和快樂(lè)

　　一旦細(xì)胞準(zhǔn)備好，我們就可以去顯微成像。不幸的是，并非所有顯微鏡都可用于活細(xì)胞成像。重要的是，它們得配備一個(gè)內(nèi)置的培養(yǎng)箱，可調(diào)節(jié)CO2的濃度和溫度，以保持細(xì)胞存活。我們將奧林巴斯 IX83 與ibidi Stage Top Incubation System加熱孵育系統(tǒng)結(jié)合使用（見(jiàn)圖 2）。它為我們提供了對(duì)溫度和CO2以及濕度的精確控制。我們通常在 37°C 和 5% CO2、 50%濕度的恒定溫溫下進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。有兩種不同的加熱板可供選擇，一種用于單腔載玻片，另一種用于一次對(duì)四個(gè)腔載玻片進(jìn)行成像，非常適合大量實(shí)驗(yàn)。

圖2) ibidi Stage Incubation System加熱孵育系統(tǒng)

　　4、選擇合適的顯微鏡和錄制設(shè)置

　　把腔室載玻片固定在加熱蓋下的板上，就可以開(kāi)始實(shí)驗(yàn)了。需要考慮的重要事項(xiàng)是顯微鏡的放大倍率、系統(tǒng)應(yīng)該多久拍照一次以及拍攝多長(zhǎng)時(shí)間。例如，由于Schwann細(xì)胞是快速移動(dòng)的細(xì)胞，因此使用比成纖維細(xì)胞更低的放大倍數(shù)是意義的，成纖維細(xì)胞的移動(dòng)速度要慢得多，遷移距離更短。我們使用cellSens Olympus Corporation軟件每10分鐘拍攝一張照片，持續(xù)至少10小時(shí)，這個(gè)是為與細(xì)胞速度和覆蓋距離相關(guān)的遷移實(shí)驗(yàn)的而做的良好設(shè)置。如果您對(duì)細(xì)胞如何移動(dòng)或?qū)厝徊煌氖挛锔信d趣，例如細(xì)胞如何吸收粒子，則縮短拍攝照片之間的時(shí)間可能是有意義的。

　　5、通過(guò)分析數(shù)據(jù)量化實(shí)驗(yàn)

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在我們的案例中，軟件呈現(xiàn)的.vsi 文件，我們通常會(huì)將這些文件轉(zhuǎn)換為.avi視頻和.tiff 圖像序列。然后，使用ImageJ，我們使用手動(dòng)跟蹤插件通過(guò)跟蹤并單擊每一幀中的單個(gè)單元格來(lái)跟蹤選定的單元格。每個(gè)單元格都有單獨(dú)的遷移路徑。然后，使用 ibidi Chemotaxis and Migration Tool評(píng)估結(jié)果，該工具可以計(jì)算平均速度、平均總距離和有效距離，以及每個(gè)單元格的方向性指數(shù)（見(jiàn)圖3）。

圖3：ibidi Chemotaxis和遷移工具插件的界面

　　最后，您可以從中獲得令人驚嘆的數(shù)據(jù)：

　　參考：

　　F. Millesi, T. Weiss, A. Mann, M. Haertinger, L. Semmler, P. Supper, D. Pils, A. Naghilou, C. Radtke. Defining the regenerative effects of native spider silk fibers on primary Schwann cells, sensory neurons, and nerve-associated fibroblasts. FASEB Journal.2021,10.1096/fj.202001447R