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　　1.介紹

　　ibidi泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)是專(zhuān)為灌注條件下的長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)節(jié)而設(shè)計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)方法是將一個(gè)載玻片連接到一個(gè)灌注裝置。在某些情況下，增加載玻片（細(xì)胞）的數(shù)量可能是有用的。例如，當(dāng)計(jì)劃進(jìn)行各種染色時(shí)，或者如果細(xì)胞數(shù)量對(duì)于后續(xù)的應(yīng)用（如FACS）不夠時(shí)。

　　本應(yīng)用是一個(gè)循序漸進(jìn)依次連接µ-Slide VI0.4六通道載玻片的實(shí)驗(yàn)方案。

　　重要提示！

　　串聯(lián)的通道承受著幾乎相同的流速，因此剪切應(yīng)力也幾乎相同。

　　我們強(qiáng)力建議串聯(lián)通道載玻片，而不是并聯(lián)！

　　我們建議按所述方式連接不要超過(guò)兩個(gè)µ-Slide VI0.4 六通道載玻片

　　2.材料

　　對(duì)于設(shè)置，需要以下材料(無(wú)菌):

　　* 串聯(lián)連接管(ibidi #10830)，5 pieces

　　* 細(xì)胞培養(yǎng)基

　　* 接種了細(xì)胞的ibidi µ-Slide VI 0.4

　　* 灌流管

　　* 1 ml注射器

　　* 軟管夾

　　* 移液吸頭

　　重要提示！

　　將串聯(lián)連接管、細(xì)胞培養(yǎng)基、通道載玻片和灌注裝置在培養(yǎng)箱中平衡一整晚!

　　本方案的所有步驟都應(yīng)在無(wú)菌條件下完成!

　　3.準(zhǔn)備工作

　　整個(gè)設(shè)置相當(dāng)于只有一個(gè)通道的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)。 唯一的區(qū)別是，在將整個(gè)組件連接到Perfusion Set之前，先將多個(gè)通道串行連接起來(lái)。

　　3.1.接種細(xì)胞

　　像往常一樣在µ-Slide VI 0.4的通道中接種細(xì)胞。如果需要進(jìn)一步的靜態(tài)培養(yǎng)，讓細(xì)胞附著并在附著后用60µl無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲(chǔ)液池。詳細(xì)說(shuō)明見(jiàn)“使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法匯總”。細(xì)胞貼壁后，就可以進(jìn)行載玻片的串連了。

　　3.2.泵設(shè)置

　　按照“使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法匯總”中的說(shuō)明準(zhǔn)備泵的設(shè)置。向灌流管的儲(chǔ)液池中各注入5ml平衡介質(zhì)，并以中壓(約50mbar)運(yùn)行泵，去除氣泡。

　　重要提示！

　　將公魯爾接頭連接到母魯爾接頭時(shí)，務(wù)必小心不要帶進(jìn)氣泡。

　　盡可能快地工作，以避免載玻片和細(xì)胞冷凝。整個(gè)過(guò)程必須在10分鐘內(nèi)完成。

　　4.串聯(lián)連接

　　通道的串聯(lián)連接是在細(xì)胞貼壁后和將載玻片連接到灌注管之前完成。

　　按照第3部分的描述準(zhǔn)備載玻片，接種細(xì)胞并貼壁        如圖所示，將五個(gè)串行連接管連接到Luer端口

　　用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基填充注液孔，直到所有注液孔完全充滿    在此步驟中，注意注液孔底部不能有氣泡

　　注意不能在注液孔中留有氣泡

　　用1ml的無(wú)菌注射器吸滿培養(yǎng)基，小心插入如圖的孔中，不要引入氣泡。

　　小心慢慢注入培養(yǎng)基，直到第一個(gè)串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出

　　小心的將串聯(lián)管彎過(guò)來(lái)，插入相鄰的Luer端口中。不要產(chǎn)生氣泡。

　　繼續(xù)推動(dòng)注射器，直到第二根串聯(lián)管也被充滿，繼續(xù)推動(dòng)注射器充滿下一根串聯(lián)管。

　　重復(fù)上面的操作，繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。

　　將所有的串聯(lián)管連接好后，將加滿液體排除氣泡的灌流管用軟管夾夾住。

　　從灌流管的母魯爾鎖定耦合器中拔出公魯爾接頭，并將其插入載玻片上末尾一個(gè)Luer端口中。在慢慢抽出注射器，用新鮮的培養(yǎng)基填滿Luer端口并去除氣泡

　　從灌流管的母魯爾鎖定耦合器中拔出第二個(gè)公魯爾接頭，并將其插入載玻片上另一端末尾的Luer端口

　　設(shè)置完成，可開(kāi)始啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。別忘了取下軟管夾！

　　串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。

　　5.調(diào)整流速

　　軟件中無(wú)法預(yù)見(jiàn)多個(gè)通道載玻片的設(shè)置。需要調(diào)整泵的參數(shù)以適應(yīng)新的要求。作為指南您可以在軟件中選定正在使用是µ-Slide VI0.4通道載玻片。由此產(chǎn)生的流速(以及剪切應(yīng)力)將低于在單通道的應(yīng)用中。用所需的剪切應(yīng)力啟動(dòng)一個(gè)循環(huán)，手動(dòng)測(cè)量流速(ibidi Pump Instructions, page 40（可聯(lián)系我們索要電子版文檔）)。然后進(jìn)入重新校準(zhǔn)對(duì)話框，輸入計(jì)算的（軟件給定的流速）和測(cè)量的流速。