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　　本實驗描述了將斑馬魚幼蟲嵌入低百分比低熔點瓊脂糖進行延時顯微鏡觀察的過程。根據(jù)科學問題，可以在瓊脂糖嵌入的幼蟲中觀察不同的發(fā)育階段：這可以包括在卵殼內的最初48小時的發(fā)育，或孵化后的時間（受精后48-120小時）。

　　

　　1.相關文件

　　

　　• µ-Slide 2 Well Co-Culture的使用說明書

　　

　　2.材料和試劑

　　

　　2.1.動物

　　

　　• 斑馬魚幼蟲（受精后最長達120小時）

　　

　　2.2.緩沖液和溶液

　　

　　魚類水（60倍）

　　

　　• 172克氯化鈉（ROTH，P029.2）

　　

　　• 7.6克氯化鉀（ROTH，6781.1）

　　

　　• 29克CaCl2 x 2 H2O（ROTH，CN92.2）

　　

　　• 49克MgSO4 x 7 H2O（ROTH，P027.1）

　　

　　• 加入脫離水達到10升

　　

　　魚類水（1倍）

　　

　　• 160毫升魚類水（60倍）

　　

　　• 20毫升0.01％（w / v）亞甲藍（Sigma-Aldrich，M9140）在去離子水中

　　

　　• 加入脫離水達到10升

　　

　　Tricaine儲備溶液

　　

　　• 4 g / l Tricaine / MS-222（Sigma Aldrich，A5040）

　　

　　• 0.02 M三氯甲烷（ROTH，4855.2），pH 9

　　

　　• 在去離子水中

　　

　　Tricaine使用溶液

　　

　　• 在魚類水（1倍）中稀釋Tricaine儲備溶液，以最終濃度為160毫克/升（1:25）

　　

　　0.5% 低熔點瓊脂(LMPA)

　　

　　• 可以批量制備并分成小份用于每個實驗

　　

　　• 在微波爐中將0.5%（w/v）低熔點瓊脂（Biozym, 840101）與魚水（1x）一起煮沸，直到瓊脂完全溶解

　　

　　• 讓瓊脂冷卻到約35°C左右

　　

　　• 添加Tricaine庫存溶液，最終濃度為80 mg/L（1:50）

　　

　　最終的低熔點瓊脂濃度可以調整。例如，我們成功地使用了高達2%的低熔點瓊脂，但決定使用0.5%的低熔點瓊脂進行實驗，因為它不太可能影響生理過程。

　　

　　2.3.設備

　　

　　

(ibidi, 81806)

　　

　　• 熱混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　

　　• µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，ibiTreat底部處理 (ibidi, 81806)

　　

　　• 塑料移液管

　　

　　• 可選: 小刷子

　　

　　• 顯微鏡

　　

　　3.實驗步驟

　　

　　準備工作

　　

　　在開始實驗之前，按照“緩沖液和溶液”部分的描述準備LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果瓊脂已經(jīng)提前準備好，可以在熱混合器中重新加熱 (~80°C)，然后讓瓊脂冷卻 (~35°C)。

　　

　　裝載

　　

　　在使用µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片之前，請先閱讀說明書。

　　

　　在我們小組的某些實驗中，對斑馬魚脊髓進行了機械性損傷。如果這樣做，建議請在裝載前讓幼魚恢復至少30分鐘。在脊髓橫切后，嵌入瓊脂的初始存活率為80%。這些幼魚在瓊脂中觀察48小時后也都存活了。未受傷的幼魚的初始存活率接近100%。

　　

　　1. 使用三氯甲烷使用溶液麻醉斑馬魚幼魚2分鐘。

　　

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片的每個孔中放置一只幼魚，并使用一些多余的魚水。

　　

　　3. 對每只幼魚單獨執(zhí)行以下步驟（以避免變干）：

　　

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有魚水。

　　

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆蓋幼魚。

　　

　　3.3. 使用刷子或小的移液管頭將幼魚定位到適當?shù)奈恢茫▊让嫖恢?，盡可能水平和直立，具有統(tǒng)一的對準，即始終向左，卵黃在底部）。

　　

　　4. 讓LMPA凝膠固化（0.5%凝膠約需20-30分鐘）。

　　

　　5. 可選：用包含80mg / L三氯甲烷庫存溶液的1x魚水覆蓋固化的LMPA凝膠，以進行連續(xù)成像的麻醉。

　　

　　6. 用自帶的蓋子蓋住µ-Slide 2孔共培養(yǎng)載玻片，以避免蒸發(fā)。

　　

　　7. 斑馬魚幼魚已經(jīng)上樣好準備成像

　　

　　在48小時的成像期間，如果蓋子緊閉，則無需在瓊脂上方加入魚水，因為標本不會變干。這也使得可以進行正置顯微鏡觀察，而不必擔心灑出來。

　　

　　

　　圖1：斑馬魚幼蟲嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器。

　　

　　延時顯微鏡觀察

　　

　　這種樣品制備方法被用于連續(xù)延時顯微鏡，以及使用德累斯頓技術大學CRTD的核心設施——光學顯微鏡設施的各種顯微鏡在不同時間點拍攝某些視場的快照。 這包括倒置和正置，廣角和共聚焦顯微鏡。

　　

　　

圖2：A）斑馬魚幼蟲受精后72小時，埋入瓊脂3小時后的整個µ-Slide 2孔共培養(yǎng)器的亮場瓦片掃描，共有18條幼魚。

　　

　　視頻：此示例顯示了一個短20分鐘的三維時間軸的Z投影，顯示了受機械性脊髓切斷處理的轉基因mpeg1:mCherry斑馬魚幼蟲受精后3天的情況。熒光標記的細胞是巨噬細胞和微膠質細胞。這個時間軸是用Dragonfly旋轉盤顯微鏡（Andor）獲取的。請見如下視頻：