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Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室載玻片

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)

　　

　　ibidi提供了一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的方案，使用一片可移除的腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色，無需爬片，是倒置/正置顯微鏡以及長期樣品儲(chǔ)存的理想選擇。

　　

　　本應(yīng)用提供了一種使用ibidi8孔可移除腔室載玻片（80841）培養(yǎng)、固定和染色細(xì)胞的簡單方案。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用福爾馬林溶液固定。細(xì)胞核用DAPI染色，肌動(dòng)蛋白骨架用DYE-490鬼筆肽染色。利用一級和二級抗體染色，通過免疫細(xì)胞化學(xué)可以探測其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

　　

　　實(shí)驗(yàn)使用的材料和試劑：

　　

　　

　　· 8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）

　　

　　· 可移除腔室載玻片用的蓋玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811）

　　

　　· 細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）

　　

　　· 細(xì)胞培養(yǎng)基

　　

　　· 細(xì)胞培養(yǎng)試劑

　　

　　· PBS緩沖液

　　

　　· 福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）

　　

　　· 染色試劑

　　

　　o  DAPI（Sigma，D954）

　　

　　o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）

　　

　　· 封片劑：Fluoroshield^TM（Sigma，F(xiàn)6182）

　　

　　實(shí)驗(yàn)方案

　　

　　細(xì)胞培養(yǎng)，固定，染色和成像觀察--都是在一個(gè)開放型小室中搞定：）

 

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　　步驟1：

　　

　　必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用4-6x10⁴細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。

　　

　　1.在無菌條件下，打開8孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）包裝。

　　

　　2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×10⁴細(xì)胞/ ml MCF-7。

　　

　　3. 將400微升細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

　　

　　4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO₂下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立融合的單層。

　　

　　步驟2：

　　

　　固定是染色程序的第一步。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長時(shí)間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。

　　

　　1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。

　　

　　2.用PBS洗兩次。

　　

　　3.加入400μl福爾馬林溶液。

　　

　　4.在室溫下孵育30分鐘。

　　

　　5.小心吸入福爾馬林溶液。

　　

　　6.用PBS洗滌三次。

　　

　　步驟3：

　　

　　應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。

　　

　　1.準(zhǔn)備你的染色溶液：

　　

　　· PBS

　　

　　· DYE-490鬼筆環(huán)肽

　　

　　· DAPI 1μg/ml

　　

　　2.小心吸出PBS。

　　

　　3.移取400μl染色溶液到每個(gè)孔中

　　

　　4.在室溫下避光孵育30分鐘

　　

　　步驟4：

　　

　　染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號

　　

　　1.小心地吸出染色溶液

　　

　　2.加入400μl緩沖液

　　

　　3.小心地吸出緩沖液

　　

　　4.重復(fù)步驟2和步驟3至少一次

　　

　　步驟5：

　　

　　從一個(gè)邊緣開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

　　

　　

　　步驟6：

　　

　　完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。

　　

　　1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。

　　

　　2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。

　　

　　Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。

　　

　　3.等封片劑固定好。

　　

　　

　　步驟7：顯微觀察

　　

　　

　　在可移除8孔腔室載玻片中免疫染色的MCF-7細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白，紅色：F-肌動(dòng)蛋白（鬼筆環(huán)肽），藍(lán)色：細(xì)胞核 (DAPI)。使用20倍物鏡拍攝寬場熒光圖像。

　　

　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)實(shí)例

　　

　　

　　人眼的小梁網(wǎng)細(xì)胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除載玻片中。F-肌動(dòng)蛋白絲顯示為綠色；細(xì)胞核被 DAPI（藍(lán)色）染色。圖片由中國香港香港理工大學(xué)視光學(xué)院的Samantha Shan提供。

　　

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