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　　什么是相差顯微鏡（Phas Contrast Microscopy）?

　　相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家澤尼克Zernike于1935年發(fā)明的，并于1955年獲得諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。相差顯微鏡是一種特殊的顯微鏡，特別適用于觀察具有很高透明度的對(duì)象，例如生物切片、油膜和位相光柵等等。光波通過(guò)這些物體，往往只改變?nèi)肷涔獠ǖ奈幌喽桓淖內(nèi)肷涔獠ǖ脑龇?，由于人眼及所有能量檢測(cè)器只能辨別光波強(qiáng)度上的差別，也即振幅上的差別，而不能辨別位相的變化，因此用普通顯微鏡是難以觀察到這些物體的。透明度很高的物體，也稱為位相物體。相襯法（也叫位相反襯法）是通過(guò)空間濾波器將物體的位相信息轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的振幅信息，從而大大提高透明物體的可分辨性，該方法使科學(xué)家能夠以高水平的細(xì)節(jié)觀察有機(jī)和生物樣品，而不需要進(jìn)行樣品制備、染色或標(biāo)記。所以從這個(gè)意義上說(shuō)，相襯法是一種光學(xué)信息處理方法，而且是最早的信息處理的成果之一，因此在光學(xué)的發(fā)展史上具有重要意義。

　　相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是: 用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。

　　用途

　　相差顯微鏡主要用于觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。

　　基本原理：

　　相差顯微鏡利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過(guò)物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）的差別，經(jīng)過(guò)帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

　　相差顯微鏡把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過(guò)標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來(lái)的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長(zhǎng)），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個(gè)特殊之處：

　　1.環(huán)形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

　　2.相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

　　（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

　　（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。

　　3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡 (centring telescope)：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。

　　相差顯微鏡有哪些優(yōu)點(diǎn)？

　　相位對(duì)比顯微鏡的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是可以自然地研究任何活細(xì)胞，而不需要固定、標(biāo)記或染色。

　　該技術(shù)產(chǎn)生的所有圖像可以是無(wú)標(biāo)簽的。這也為研究人員節(jié)省了時(shí)間，并減少了實(shí)驗(yàn)之間出現(xiàn)錯(cuò)誤或變化的機(jī)會(huì)。

　　相位對(duì)比法對(duì)透明樣品效果很好，因?yàn)轭~外的干擾使樣品更加明顯。在這種技術(shù)中，整個(gè)物體都被照亮了。

　　對(duì)于研究活細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)成分，相襯顯微鏡提供了相對(duì)較高的分辨率。細(xì)胞線粒體、有絲分裂的染色體、空泡和其他活細(xì)胞成分都可以用這種方法來(lái)研究。

　　相差顯微鏡的組件也可以添加到幾乎所有類型的光學(xué)顯微鏡中，只要相位物鏡符合顯微鏡的管長(zhǎng)參數(shù)，聚光器可以與正確尺寸的環(huán)形相位環(huán)聯(lián)姻。這使得它成為一種靈活和廣泛適用的技術(shù)。

　　相差顯微鏡要考慮的一個(gè)重要問題是什么？以及ibidi提供的解決方式是？