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 　　這是在µ-Slide Chemotaxis細胞趨化載玻片中進行3D趨化性實驗后，對嵌入Matrigel®中的HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細胞）進行免疫熒光染色的詳細實驗方案。在Matrigel®中，趨化性細胞向10％FCS遷移之后，通過免疫細胞化學(xué)染色研究了定向細胞遷移的形態(tài)學(xué)特征。

　　01、實驗材料準備

　　µ-Slide Chemotaxis

　　02、實驗步驟

　　將HUVEC接種在50％Matrigel®中，并填充至µ-Slide Chemotaxis中，然后將其沿10％FCS梯度遷移24小時。采用免疫染色法觀察內(nèi)皮細胞在Matrigel®中定向遷移后的形態(tài)學(xué)特征。HUVEC的染色是直接在µ-Slide細胞趨化載玻片中進行的。在染色方案的所有步驟中，將60 µl的相應(yīng)溶液分別添加到兩個大儲液池中。在孵育過程中，所有塞子均保持關(guān)閉狀態(tài)，以免干擾通過觀察通道的擴散。除非另有說明，否則所有步驟均在室溫下進行。

　　1) 從一邊儲液池中取出塞子，然后吸出培養(yǎng)基。在抽吸和沖洗步驟中，將塞子留在中央通道中。

　　2) 用1x PBS洗滌→3x 10分鐘

　　3) 用4％多聚甲醛固定細胞和基質(zhì)蛋白→1x 40分鐘

　　4) 用1x PBS洗滌→2x 10分鐘

　　5) 用0.2％Triton X-100 / PBS透化細胞→1x 20分鐘

　　6) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　7) 用1% BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過夜

　　8) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　9) 添加一抗：單克隆抗VE鈣黏著蛋白，小鼠（在1％BSA / PBS中為1：100）→在4°C下1x 24小時

　　10) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG（H + L），Alexa Fluor 680（在1％BSA / PBS中為1:50）→在4°C過夜

　　12) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　13) 加入染色混合物→1x 40分鐘

　　i) 羅丹明phalloidin染色肌動蛋白絲（PBS中1：400）

　　ii) Hoechst 33342對細胞核染色（1：100，PBS中0.5 µg/ml）

　　14) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　15) 將最后的PBS留在儲液罐中并開始成像。

　　免疫熒光圖像由LeicaSP8SMD共聚焦激光掃描顯微鏡獲得，配以63xHCPLAPO1.2NA水物鏡。用405nm紫外激光激發(fā)Hoechst 33342，594nmHeNe激光激發(fā)羅丹明-phalloidin，638nmHeNe激光激發(fā)AlexaFluor680。

　　重要提示:與標準染色方案相比，洗滌和染色步驟所需的培養(yǎng)時間更長。這是為了確?？贵w通過凝膠充分擴散。

　　03、實驗結(jié)果

　　HUVEC在Matrigel®基質(zhì)中的免疫染色顯示，相鄰的細胞組優(yōu)先形成細胞簇并作為集合體遷移。少數(shù)細胞呈單細胞遷移。

　　圖1：顯示HUVEC在50%Matrigel®中的多細胞趨化性的細胞簇。固定后，對細胞進行細胞核（藍色）、F-肌動蛋白（紅色）和VE鈣粘蛋白（青色）染色。白色箭頭表示VE介導(dǎo)的細胞-細胞接觸。

　　當細胞作為個體遷移時，細胞體被拉長，呈間充質(zhì)梭形。細胞呈前后極性，前緣呈小片狀，向梯度方向有突起。

　　當以多細胞單元組織時，細胞團簇表現(xiàn)出明顯的前后不對稱的群極化（圖1）。在這里，一個或幾個前導(dǎo)細胞參與了前緣的形成，前緣表現(xiàn)出細長的突起或?qū)挼钠瑢?。遷移復(fù)合體較深區(qū)域的連續(xù)細胞沒有極化。然而，這些細胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導(dǎo)的細胞-細胞接觸（圖1）。

　　04、訂購信息