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　　細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)原理

　　定義：趨化性（Chemotaxis，亦被稱為化學(xué)趨向性）是趨向性的一種，指身體細(xì)胞、細(xì)菌及其他單細(xì)胞、多細(xì)胞生物依據(jù)環(huán)境中某些化學(xué)物質(zhì)而趨向的運(yùn)動(dòng)。這對(duì)細(xì)菌尋找食物 (如葡萄糖) 十分重要，細(xì)菌以此趨進(jìn)有較高食物分子濃度的地方，或遠(yuǎn)離有毒 (如苯酚) 的地方。在多細(xì)胞生物中，趨化性對(duì)其發(fā)展和其他正常功能一樣不可或缺。正趨化性指趨向較高化學(xué)物質(zhì)濃度的運(yùn)動(dòng)，而負(fù)趨化性則相反。

　　下面，我們介紹一個(gè)使用ibidiμ-Slide Chemotaxis3D分析嵌入3D牛膠原蛋白基質(zhì)中的小鼠樹突狀細(xì)胞的趨化性的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案。

　　使用ibidiμ-Slide Chemotaxis細(xì)胞趨化載玻片的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)，可以實(shí)時(shí)觀察記錄細(xì)胞的趨化行為。

　　一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

　　1）儀器：

　　細(xì)胞培養(yǎng)箱（高濕度，37℃，5%CO2）

　　帶定時(shí)拍照功能的倒置相差顯微鏡

　　鏡載加熱孵育系統(tǒng)（37℃，5%CO2）

　　可選配置：全自動(dòng)載物臺(tái)，自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)（x，y，z），可平行觀察3個(gè)腔室和多達(dá)4個(gè)玻片。

　　分析軟件：ImageJ插件“手動(dòng)跟蹤”和“ibidi的趨化和遷移工具

　　注意：低倍率物鏡（4x-10x）提供了更大的聚焦深度，因此是有利的。

　　2）樹突細(xì)胞的培養(yǎng)：

　　樹突狀細(xì)胞(第8-10天)應(yīng)用200 ng/ml LPS(在細(xì)胞培養(yǎng)基中，如表1所示)過(guò)夜激活。

　　表一：樹突細(xì)胞培養(yǎng)所需的試劑和培養(yǎng)基

　　3）基質(zhì)膠制備，Collagen I，bovine，1.6mg/ml

　　樹突狀細(xì)胞的化學(xué)趨化實(shí)驗(yàn)所需的耗材和試劑（如下表二）：

　　表二：化學(xué)趨化需要的耗材和試劑

　　表三：1.5 mg/ml牛膠原蛋白I凝膠的組成

　　操作步驟：

　?、?使用表一中的培養(yǎng)基制備9 x 106 cells/ml的細(xì)胞懸液

　?、?在1.5ml離心管中小心混勻表三中的成分1，2，3和4，避免產(chǎn)生氣泡

　?、?在另一1.5ml離心管中準(zhǔn)備150μl的膠原蛋白（成分5）

　?、?使用200μl槍頭將步驟2中的100µl混合物轉(zhuǎn)移到膠原蛋白管中（圖一A）

　?、菪⌒幕靹颍▓D一B），務(wù)必避免產(chǎn)生氣泡

　?、?向混合液中加入50μl細(xì)胞懸液（圖一C）

　　⑦ 小心混勻（圖一D），務(wù)必避免產(chǎn)生氣泡

　?、?隨后，立即將混合物填充到通道中

　　⑨ 將載玻片放入培養(yǎng)箱45分鐘使其凝固。之后，膠原纖維就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)。

　　二、細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

　　1）趨化試劑：

　　化學(xué)趨化物：CCL19 (1.25 µg/ml in RPMI 1640 supplemented with 10%FCS)

　　無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基：RPMI 1640 supplemented with 10% FCS

　　操作步驟：

　　① 凝膠凝膠化后，用不含化學(xué)趨化物或含化學(xué)趨化物的培養(yǎng)基加入細(xì)胞趨化載玻片的儲(chǔ)液池中。

　　② 用65µl含有化學(xué)趨化物的培養(yǎng)基填充一個(gè)儲(chǔ)液池，用65μl無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基填充另一個(gè)儲(chǔ)物池作為細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（+/-）。

　　③ 作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)（-/-），用65µl無(wú)化學(xué)趨化物培養(yǎng)基填充兩個(gè)儲(chǔ)液池。

　?、?按說(shuō)明，將通道加液孔用塞子塞緊后可以進(jìn)行圖像采集。

　　⑤ 將載玻片置入鏡載加熱孵育系統(tǒng)中。

　　⑥ 調(diào)整好采集位點(diǎn)，進(jìn)行4小時(shí)的觀測(cè)，每2分鐘采集一張圖片。

　　圖1.顯微鏡觀察：由于3D環(huán)境，并非所有細(xì)胞都能完全聚焦，這取決于所使用的物鏡

　　三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　如果滿足以下參數(shù)并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，則可以假設(shè)細(xì)胞定向遷移:

　　1）趨化實(shí)驗(yàn)的FMIII值大于fmii值，且p值<0.05;

　　2）各對(duì)照實(shí)驗(yàn)的FMIII和fmil應(yīng)在零左右，p值應(yīng)為p>0.05。

　　表四：HT1080細(xì)胞遷移參數(shù)比較。趨化性實(shí)驗(yàn)和對(duì)照實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)如下表所示。CCL19作為化學(xué)趨化物

　　當(dāng)使用CCL19作為化學(xué)引誘劑時(shí)，可觀察到趨化反應(yīng)。趨化實(shí)驗(yàn)的FMIII和p值(瑞利檢驗(yàn)的p值)都表明有定向細(xì)胞遷移。相反，在沒(méi)有CCL19(對(duì)照實(shí)驗(yàn))的情況下，可以觀察到隨機(jī)遷移。

　　圖2. 在1.5mg/ml膠原凝膠中培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞的代表性細(xì)胞軌跡圖。給出了趨化性實(shí)驗(yàn)（a）和對(duì)照實(shí)驗(yàn)（b）的結(jié)果