為了模擬腫瘤復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境，三維腫瘤球體模型已成為重要的體外模型系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)方案詳細(xì)闡述了使用ibidi µ-Slide I Luer 3D(貨號：87176)將嵌入I型膠原的腫瘤球體與內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）共培養(yǎng)。該模型還可以通過灌流培養(yǎng)技術(shù)來模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件，尤其適用于研究腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。
灌流共培養(yǎng)示意圖
ibidi為球狀體和類器官灌注培養(yǎng)提供各種解決方案：
關(guān)鍵詞：3D培養(yǎng)模型、腫瘤微環(huán)境、3D共培養(yǎng)；內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤球狀體、腫瘤血管生成
01、實(shí)驗(yàn)材料
重要提示：本方案針對MCF腫瘤細(xì)胞球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化；使用其他細(xì)胞球狀體或內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，請調(diào)整試劑和緩沖液。
1.1試劑和緩沖液
• 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，12203，Promocell公司）
• Tumor-Spheroids腫瘤細(xì)胞球狀體（此處使用MCF-7，CLS訂單號：Cryovial 300273，Vital：330273)
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基（ECGM，Promocell，C-22010）
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基 2（ECGM 2，Promocell，C-22011）
• PBS (14190144, Gibco)
• Accutase細(xì)胞解離液（A1110501，Gibco）
• I膠原蛋白，大鼠尾，非胃蛋白酶化，5mg/ml（ibidi，50301），在17.5 mM乙酸中稀釋至4mg/ml
• 10x RPMI 1640（Sigma，R1145）
• 1x RPMI 1640（Sigma，R8758）
• 培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（如 L-谷氨酰胺，視細(xì)胞類型而定）
• 1 M 超純水中的 NaOH
• 7.5%碳酸氫鈉（Sigma，S8761）
• 無菌超純水
1.2 設(shè)備與耗材
• µ-Slide I Luer 3D通道載玻片，ibiTreat 表面處理(貨號：87176)
• ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)(10902) 含一套灰色灌注管套裝(貨號：10968)
• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（超凈工作臺(tái)、細(xì)胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭、培養(yǎng)皿等）
• 倒置顯微鏡
• 冰塊和冷卻架
重要提示：為避免產(chǎn)生氣泡，灌注裝置和培養(yǎng)基的脫氣至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)開始前一天將以下部件放入培養(yǎng)箱中。只要不打開包裝，就能保持無菌狀態(tài)。
• 灌注裝置（在包裝內(nèi)）
• 用于細(xì)胞接種的細(xì)胞培養(yǎng)基（在小容器中加入所需體積的培養(yǎng)基，并稍微松開蓋子）
由于氣體在水和塑料中的溶解度與溫度有關(guān)，因此有必要采用這一程序。在較高溫度下，水和塑料吸收的氣體比在較低溫度下少。
02、制備含球狀體的3D凝膠
在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。
1. 取出先前生成的球狀體（例如，根據(jù)說明書使用µ-Slide Spheroid Perfusion球體灌注通道載玻片）并在室溫下將其收集到層流罩下的試管中。
2. 如果凝膠基質(zhì)中需要補(bǔ)充劑，可將其添加到1x細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩中的冰塊上。
3. 將所有剩余成分和一個(gè)容量足以容納總凝膠體積的無菌試管放在層流罩中的冰上
4. 用移液管將除膠原蛋白和細(xì)胞懸浮液外的所有成分按表1所列順序移入試管中，并將其置于冰上。通過上下移液混合，然后放回冰上。
移取膠原凝膠的重要注意事項(xiàng)：
* 移取凝膠時(shí)一定要使用預(yù)冷移液器吸頭（4°C）。
* 由于膠原蛋白I凝膠基質(zhì)的粘度較高，建議在制備膠原蛋白I 膠基質(zhì)的所有步驟中都采用反向移液法。將移液器按壓至第二個(gè)壓力點(diǎn)，將凝膠注入整個(gè)移液器吸頭。僅在達(dá)到第一個(gè)壓力點(diǎn)之前分配凝膠。這樣移液器吸頭中會(huì)有殘留的凝膠需要丟棄，但體積會(huì)更加精確。另外，您也可以使用專為高粘度溶液設(shè)計(jì)的移液器。我們推薦使用Eppendorf Visco吸頭或 Gilson Microman E吸頭。
注意：即使在4°C溫度下，凝膠混合物也最多可使用5分鐘，然后會(huì)發(fā)生部分凝膠化。
5. 確保I型膠原蛋白大鼠尾在17.5 mM乙酸中稀釋至4.0 mg/ml，請查看分析證書 (CoA) ，以了解批次特定的膠原蛋白濃度。
注意：在稀釋膠原蛋白之前，必須用移液器上下移動(dòng)幾次，使其充分混合，以形成均勻的溶液。
6. 將膠原蛋白加入步驟5中制備的混合物中。用移液器充分混合，同時(shí)始終將試管置于冰上。
7. 將制備好的球狀體懸液加入混合物中。盡量在50µl的體積中拾取更多的球狀體。在最后一步中，通過短渦旋混合樣品。
8. 現(xiàn)在可以將混合物移入 µ-Slide I Luer 3D中。移液過程中，請將載玻片放在冰上。
提示：為避免因冰而劃傷，請將µ-Side放入培養(yǎng)皿中，然后將帶有玻片的培養(yǎng)皿放在冰上。
使用µ-Slide I Luer 3D的實(shí)驗(yàn)流程示意圖
9. 取下載玻片上側(cè)的保護(hù)膜，然后在每個(gè)孔中加入16µl含有細(xì)胞球狀體的膠原凝膠。注意避免產(chǎn)生氣泡。
10. 然后，將蓋玻片放在載玻片的粘性部分。按壓蓋玻片以確保粘合區(qū)域密封嚴(yán)實(shí)。
11. 用隨附供的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無菌，然后將裝有凝膠的載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5% CO2 ）中培養(yǎng)45分鐘，使其凝膠化。
12. 凝膠化后，使用10倍物鏡的相差顯微鏡觀察，可以看到膠原纖維。
表1.使用I型膠原蛋白和DMEM制備凝膠的移液方案，所有成分均按移液順序排列
03、接種內(nèi)皮細(xì)胞
在無菌條件下執(zhí)行以下所有步驟。
1. 使用ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注時(shí)，如本文1實(shí)驗(yàn)材料所述，在實(shí)驗(yàn)前一天將灌流管套裝和內(nèi)皮生長培養(yǎng)基（ECGM和ECGM2）放入37°C的培養(yǎng)箱中預(yù)熱。
2. 用Accutase處理HUVEC1-2分鐘，使其脫離。
3. 收集細(xì)胞懸浮液，離心，用少量培養(yǎng)基（ECGM）稀釋后進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4. 計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將其調(diào)整至培養(yǎng)基中1.5×106 cells/ml的最終濃度。
5. 用生物兼容的1ml注射器將約 250µl細(xì)胞懸浮液注入通道。
6. 用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭移除Luer魯爾接頭中殘留的細(xì)胞懸液，用隨附的蓋子蓋住Luer魯爾接頭以保持無菌。
7. 將載玻片連同無菌濕巾放入培養(yǎng)皿中，然后其放入（37°C, 5% CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
04、連接ibidi泵系統(tǒng)進(jìn)行灌注
連接ibidi pump system泵系統(tǒng)/流體剪切力系統(tǒng)進(jìn)行灌注
重要提示：內(nèi)皮生長培養(yǎng)基2含有誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和發(fā)芽的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子。
1. 在細(xì)胞培養(yǎng)期間，按照ibidi Pump System中的說明準(zhǔn)備ibidi Pump System。將ECGM2培養(yǎng)基注入儲(chǔ)液池。
2. 孵育2小時(shí)后，將載玻片連接灌注系統(tǒng)，并注入ECGM2培養(yǎng)基。
3. 如需進(jìn)行延時(shí)系列成像，將載玻片放入顯微鏡載物臺(tái)上的培養(yǎng)腔室（如ibidi Stage Top Incubator加熱孵育系統(tǒng))并開始延時(shí)成像。如需單幀成像，請?zhí)崆霸O(shè)置好顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時(shí)間。不成像時(shí)，將載玻片放回培養(yǎng)箱。若要進(jìn)行終點(diǎn)分析，請?jiān)趯?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)固定細(xì)胞，然后繼續(xù)染色（見本文「染色」章節(jié))或執(zhí)行下游方案。
灌注培養(yǎng)條件下的延時(shí)成像實(shí)驗(yàn)裝置示意圖
05、活細(xì)胞相差成像示例
相差鏡檢圖像：在基質(zhì)膠上生長的細(xì)胞球狀體(A)與接種2小時(shí)后的HUVEC細(xì)胞(B)。(C) 在灌注條件下(流速約為0.5ml/min)共同培養(yǎng)3天后的球狀體和HUVEC細(xì)胞。
06、染色
6.1 材料
• PBS (14190144, Gibco)
• 10%福爾馬林，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）
• Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體，MA5-18135 Invitrogen）
• Phalloidin-iFluor 647試劑（ab176758，Abcam ）
• 4′,6-diamidino-2-phenyl-indole （DAPI）（D9542 Sigma Aldrich）
• Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）
• 破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 加入 PBS）
• 封閉緩沖液（1% BSA + 0.2% Triton X-100 in PBS）
• 抗體稀釋緩沖液（PBS 中含 1% BSA + 0.05% Triton X-100）
• 牛血清白蛋白（BSA）（A1470-10G，Sigma Aldrich）
6.2 染色步驟
1. 為實(shí)驗(yàn)制備充足的破膜緩沖液和封閉緩沖液。
2. 斷開載玻片與泵之間的連接。
3. 用移液器從Luer魯爾接頭處吸出細(xì)胞培養(yǎng)液。
4. 在一個(gè)Luer魯爾接頭注入200µl PBS，輕輕清洗細(xì)胞兩次，直到看到液體從另一個(gè)Luer魯爾接頭流出。
5. 用10%福爾馬林替換PBS固定細(xì)胞。首先，從Luer魯爾接頭吸去PBS，然后向Luer接頭處加入200µl福爾馬林，讓它流過載玻片的通道，然后從Luer魯爾接頭處吸去，再向Luer魯爾接頭中加入200µl福爾馬林，并孵育細(xì)胞15分鐘。
6. 吸去福爾馬林，用100µl PBS沖洗細(xì)胞四次。
7. 將細(xì)胞放入200µl破膜緩沖液中孵育10分鐘（與步驟5一樣，用破膜緩沖液替換PBS）。
8. 去除破膜緩沖液，用200µl PBS沖洗細(xì)胞兩次。
9. 用200µl封閉緩沖液封閉30分鐘（與使用福爾馬林時(shí)一樣，用封閉緩沖液替換PBS）。
10. 在封閉期間，制備充足的抗體稀釋緩沖液來稀釋一抗和二抗。
11. 用抗體稀釋緩沖液稀釋標(biāo)記抗體（或一抗）（1:100稀釋度）。
12. 用200µl一抗溶液替換封閉緩沖液，然后在4°C孵育細(xì)胞過夜。
13. 在接下來的所有步驟中，應(yīng)盡可能將樣品置于暗處，以避免光漂白效應(yīng)。
14. 用200µl封閉緩沖液清洗三次。
15. 在相同的抗體（Phalloidin 647 Conjugate 1:1000 稀釋, DAPI 10 µg/ml）中稀釋（第二抗體和）Phalloidiin和DAPI。
16. 用200µl的二次染色液替換封閉緩沖液，并在暗處孵育2小時(shí)。
17. 用200µl封閉緩沖液清洗三次。
18. 用PBS替換封閉緩沖液（每個(gè)通道200µl）
19. 將載玻片置于4°C黑暗處保存，直至鏡檢。理想情況下，應(yīng)立即進(jìn)行成像，因?yàn)榇娣艜r(shí)間過長會(huì)降低成像質(zhì)量。
在灌注條件下共培養(yǎng)3天后，對球狀體和HUVEC細(xì)胞進(jìn)行染色；細(xì)胞核：DAPI（藍(lán)色），肌動(dòng)蛋白絲：Phalloidin iFluor 647（紅色），CD31（HUVEC特異性標(biāo)記）：Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗CD31抗體（綠色）
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