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 　　本應(yīng)用闡述了使用 µ-Slide I Luer _0.8 通道載玻片（ibidi，貨號(hào)80196）在靜態(tài)條件下培養(yǎng)細(xì)菌生物膜，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）與掃描電子顯微鏡鏡（SEM）聯(lián)合成像的實(shí)驗(yàn)方案。

　　

　　將銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa  DSM 50071_T 接種到 µ-Slide I Luer _0.8 通道載玻片中，培養(yǎng)3天。為促進(jìn)細(xì)胞貼壁及表面生物膜的形成，在培養(yǎng)約36小時(shí)后更換培養(yǎng)基，以去除游離細(xì)胞。為確認(rèn)生物膜的形成，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加了無毒光學(xué)示蹤劑EbbaBiolight 680，該試劑適用于活細(xì)胞成像，它與細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出紅色熒光，從而可作為細(xì)菌生物膜的可視化標(biāo)記。

　　

　　基于用DAPI進(jìn)行DNA染色并用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像的結(jié)果，細(xì)菌細(xì)胞附著并主要形成單層或雙層結(jié)構(gòu)。通過光學(xué)示蹤劑發(fā)出的熒光信號(hào)增強(qiáng)，可以識(shí)別出更厚的生物膜結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)旨在在同一張載玻片上結(jié)合多種成像技術(shù)。因此，在CLSM成像后，將細(xì)胞固定在同一張載玻片上，進(jìn)行脫水處理，然后干燥，以便用于掃描電子顯微鏡（SEM）成像。實(shí)驗(yàn)室自制了一個(gè)3D模具，用于分離蓋玻片，確保在操作過程中不破壞貼壁細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)。隨后，在分離出的蓋玻片上，對(duì)形成的細(xì)菌細(xì)胞層進(jìn)行2000倍至15000倍的放大成像。

　　

　　1、材料與試劑

　　•銅綠假單胞菌培養(yǎng)物 Pseudomonas aeruginosa culture（DSMZ，50071）

　　•胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）

　　•大豆蛋白胨（Millipore，1.07212）

　　•葡萄糖（VWR，24379）

　　•氯化鈉（NaCl，VWR，27800）

　　•磷酸氫二鉀(K2HPO4, Sigma, P3786)

　　•磷酸鹽緩沖液（PBS，Sigma，P7994）

　　•EbbaBiolight 680（EbbaBiotech AB）

　　•4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock conc. 1 mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248)

　　•25%戊二醛（Sigma，G7776）

　　•去離子水(diH²O)

　　•無水乙醇（Sigma，34852-M）

　　

　　1.2 緩沖液與溶液

　　培養(yǎng)基

　　•Tryptic soy broth (TSB; 17 g/L tryptone, 3 g/L peptone from soymeal, 2.5 g/L glucose,5 g/L NaCl and 2.5 g/L K²HPO⁴)

　　•TSB supplemented with 1:1000 EbbaBiolight 680

　　洗滌緩沖液

　　•1xPBS

　　染液

　　•1:1000 DAPI in 1x PBS (最終濃度為1 µg/mL)

　　30%、50%、70%、90%、100% (v/v)無水乙醇稀釋液

　　•混合適當(dāng)體積的去離子水和無水乙醇制得。

　　

　　1.3 儀器與設(shè)備

　　•µ-Slide I Luer _0.8 通道載玻片，ibiTreat組織處理（ibidi，80196）

　　•層流柜

　　•通風(fēng)櫥

　　•30°C恒溫培養(yǎng)箱

　　•55°C恒溫培養(yǎng)箱

　　•移液器

　　•冰箱

　　•干燥器

　　•手術(shù)刀或刀片

　　•剪刀

　　•鑷子

　　•切割模具（如圖1所示）

　　•倒置共聚焦顯微鏡（此處指：ZEISS LSM 880）

　　•ZEN black 2.3 SP1

　　•(Fiji Is Just) ImageJ 1.54f

　　•掃描電子顯微鏡（JEOL JSM-6480LV）

　　•金鍍膜（此處指：JEOL JFC-1200 精細(xì)鍍膜機(jī)）

　　•碳膠帶

　　•JEOL JSM-6480 version 7.07

　　

　　圖1：切割模具示意圖—白色線條表示切割位置，沿著 µ-Slide I Luer _0.8 載玻片(底部)與儲(chǔ)液池外邊側(cè)(頂部)

 

 

　　　2、實(shí)驗(yàn)步驟

　　　2.1 細(xì)菌生物膜附著

　　操作µ-Slide I Luer _0.8 前請(qǐng)閱讀說明書，并遵循µ-Slide通用移液及液體更換建議。所有步驟需在無菌條件下進(jìn)行。

　　實(shí)驗(yàn)開始前，將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM 50071）接種于LB培養(yǎng)基（如100 mL錐形瓶），30°C、160轉(zhuǎn)/分鐘避光振蕩培養(yǎng)過夜。按供應(yīng)商說明，將培養(yǎng)物以1:100比例稀釋于含1:1000光學(xué)示蹤劑（optotracer）的培養(yǎng)基中（注：細(xì)胞濃度未調(diào)整至供應(yīng)商推薦的值）。

　　關(guān)鍵提示：需將所需材料（如µ-Slide）置于30°C培養(yǎng)箱中平衡過夜。平衡處理可確保材料溫度與環(huán)境一致，從而避免后續(xù)操作中因溫差導(dǎo)致氣泡形成。

　　1.根據(jù)說明書，將200 µL稀釋菌液注入µ-Slide I Luer _0.8 通道載玻片，并用隨附的蓋子密封載玻片。

　　2.室溫（RT）避光靜置2小時(shí)，使細(xì)胞沉降并附著。

　　3.向每個(gè)儲(chǔ)液池加入60 µL含光學(xué)示蹤劑的TSB培養(yǎng)基，并用蓋子封閉兩側(cè)儲(chǔ)液池。

　　4.將µ-Slide于30°C避光靜置培養(yǎng)1-2天。

　　5.按說明書從一側(cè)儲(chǔ)液池吸取100 µL液體，并加入100 µL新鮮配制的含光學(xué)示蹤劑TSB培養(yǎng)基，完成培養(yǎng)基更換。

　　6.重復(fù)上一步驟5-10次，確保培養(yǎng)基完全替換，避免氣泡產(chǎn)生。

　　7.向µ-Slide儲(chǔ)液池注入60 µL無細(xì)胞補(bǔ)充TSB培養(yǎng)基。

　　8.再次將µ-Slide置于30°C避光靜態(tài)條件下孵育1至2天，促進(jìn)進(jìn)一步貼壁及生物膜形成。

 

　　2.2 DAPI染色及共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察

　　染色直接在µ-Slide I Luer _0.8 中進(jìn)行，所有步驟需在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。

　　關(guān)鍵提示：避免一次性移除通道內(nèi)全部液體，防止細(xì)胞干燥。

　　1.置換為1×PBS緩沖液：從一側(cè)儲(chǔ)液池移除100 µL培養(yǎng)基，向另一側(cè)加入100 µL 1×PBS沖洗液。

　　2.重復(fù)步驟1（5-10次），直至培養(yǎng)基完全被1×PBS替代。

　　3.DAPI染色：按上述移液技術(shù)，將1×PBS替換為DAPI染色液，確保通道完全充滿。

　　4.室溫避光靜置孵育 µ-Slide10分鐘。

　　5.按照之前的移液技術(shù)，使用去離子水（diH²O）沖洗兩次，去除多余染料。

　　6.按照之前的移液技術(shù)，最后用1×PBS沖洗一次。

　　7.成像：使用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）拍攝附著細(xì)胞（圖2）。

　　8.將µ-Slide于4°C冷藏保存（未固定樣品最長(zhǎng)2天），以待后續(xù)處理。

　　

　　圖2：共聚焦顯微鏡下染色的銅綠微囊藻生物膜（紅色：EbbaBiolight680（Cy3.5），藍(lán)色：DAPI）。63x物鏡。細(xì)胞大多呈單層附著。一些類似于生物膜的三維結(jié)構(gòu)清晰可見，尤其是在紅色信號(hào)較強(qiáng)的部分，突出顯示了光學(xué)示蹤劑與生物膜成分的結(jié)合。

 

　　2.3 SEM 樣品制備

　　樣品制備直接在µ-Slide I Luer _0.8 中進(jìn)行，所有步驟需在通風(fēng)櫥內(nèi)完成。

　　關(guān)鍵提示：請(qǐng)勿一次性移除通道內(nèi)的全部液體，避免細(xì)胞干燥。所有清洗與溶液更換步驟均按說明書要求執(zhí)行：從一側(cè)儲(chǔ)液池移除100微升溶液1，并向?qū)?cè)儲(chǔ)液池加入100微升溶液2。重復(fù)此操作直至溶液完全替換。

　　1.固定：按2.2節(jié)步驟1的移液技術(shù)，將通道及儲(chǔ)液池內(nèi)1×PBS替換為含2.5%戊二醛的1×PBS溶液，以固定貼壁細(xì)胞

　　2.室溫孵育載玻片3-4小時(shí)（或4°C過夜）。

　　3.用1×PBS沖洗至少5次，徹底去除戊二醛。

　　4.梯度脫水：依次用30%、50%、70%、90%無水乙醇孵育15分鐘/次，使附著的生物膜脫水。

　　5.完全脫水：100%乙醇處理兩次，每次20分鐘。

　　6.干燥：將通道載玻片置于55°C培養(yǎng)箱中干燥，不要蓋上蓋子，直至液體完全蒸發(fā)（本實(shí)驗(yàn)干燥2小時(shí)）。

　　7.將µ-Slide保存于干燥器中以待后續(xù)處理。

　　8.樣品切割：按示意圖（圖3）用手術(shù)刀或刀片切割載玻片。

　　9.切割后的載玻片豎直存放于干燥器內(nèi)（可保存數(shù)周）。

　　10.鍍金：將載玻片切割為≈1 cm小段，鍍金兩次（圖4）后用于電鏡觀察。

　　

　　圖3：µ-Slide I Luer _0.8 載玻片切割示意圖。紅色虛線為切割線，彩色區(qū)域?yàn)榭梢瞥纳w玻片部分。

　　

　　圖4：附著于µ-Slide I Luer _0.8 載玻片的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）細(xì)胞及生物膜的掃描電鏡成像。（A）2000倍與（B）7500倍放大圖像。