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　　#應(yīng)用指南#

　　

 

　　血管網(wǎng)絡(luò)由哺乳動物生物體中的各種功能組成。血管將流體、氣體、分子和細(xì)胞輸送到身體的每個部位。此外，免疫細(xì)胞利用血管在全身巡邏，保護(hù)我們免受細(xì)菌、病毒和寄生蟲的侵害。

　　

　　血管形成是發(fā)育、健康和疾病過程中的關(guān)鍵過程。例如，在成人中，它發(fā)生在傷口愈合、骨骼生長、懷孕期間。血管生長失調(diào)通常與嚴(yán)重疾病有關(guān)，例如中風(fēng)、心肌梗塞、動脈硬化和關(guān)節(jié)炎。此外，腫瘤血管化是癌癥的標(biāo)志之一。

　　

　　

　　# 血管新生和血管生成 #

　　

　　管網(wǎng)絡(luò)由兩種不同的機(jī)制形成：血管新生和血管生成。

　　

　　血管新生是血管的從頭形成。中胚層前體細(xì)胞（成血管細(xì)胞）分化成內(nèi)皮細(xì)胞，然后組裝起來形成新的動脈和靜脈。

　　

　　血管生成是通過從現(xiàn)有血管發(fā)芽來擴(kuò)展血管網(wǎng)絡(luò)。

　　

　　這一系列細(xì)胞事件包括細(xì)胞通過基底膜破裂、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和細(xì)胞間通訊。

　　

　　這種嚴(yán)格調(diào)控的過程的驅(qū)動刺激之一是缺氧，它會誘導(dǎo)幾種促血管生成基因的表達(dá)。因此，血管生成的抑制或激活提供了許多治療機(jī)會。

　　

　　例如，使用貝伐單抗阻斷促血管生成血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 已被證明可以改善許多轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌 (mCRC) 和非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 患者，盡管仍然存在一些耐藥性。血管生成分析可以深入了解各種藥物的促血管生成或抗血管生成潛力，從而有助于開發(fā)新的治療方法。

　　

 

　　在血管生成期間，新血管從現(xiàn)有血管延伸。例如，內(nèi)皮細(xì)胞突破基底膜并朝著由癌細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的血管生成刺激的方向遷移。在這個遷移前沿的背后，細(xì)胞增殖和重組以形成新的三維血管。

　　

　　# 血管形成和分析 #

　　

　　在我們的身體中，內(nèi)皮細(xì)胞被基底膜包圍，基底膜是一種薄且高度特化的細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞，例如人臍靜脈細(xì)胞 (HUVEC) 被接種到基底膜樣表面（例如 Matrigel ®）上時，它們會在體外形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，從而重現(xiàn)血管生成。

 

　　

　　這種所謂的管形成試驗已被廣泛應(yīng)用于解決各種實驗問題，例如：

　　

　　1.特定藥物的促血管生成或抗血管生成潛力是什么？

　　

　　2.哪些基因和通路參與血管生成？

　　

　　3.抑制劑或增強(qiáng)劑對管形成有何影響？

　　

　　4.血管生成過程中信號如何轉(zhuǎn)導(dǎo)？

　　

　　5.血管生成過程中的細(xì)胞骨架效應(yīng)是什么？

　　

　　6.哪些細(xì)胞是內(nèi)皮祖細(xì)胞？

　　

　　

　　使用 ibidi Stage Top Incubation System 的活細(xì)胞成像 顯示了管形成試驗中 HUVEC 的管形成。

　　

　　基底膜表面及其成分是管形成試驗成功的關(guān)鍵。可以應(yīng)用不同類型的基底膜（例如，Matrigel ®、膠原蛋白或其他水凝膠基質(zhì)），這會導(dǎo)致不同的管形成率。內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)上分化形成管。細(xì)胞首先附著在基質(zhì)上并相互遷移。然后，它們附著在其他細(xì)胞上，對齊并形成毛細(xì)管狀管。管子成熟直到細(xì)胞最終經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致從表面脫離和管子破壞。

　　

　　管形成試驗是通過首先接種單個細(xì)胞，然后隨著時間的推移觀察和成像管形成來進(jìn)行的。隨著時間的推移，可以對幾個讀數(shù)進(jìn)行成像和分析，例如管長度和循環(huán)數(shù)。通常，管子在幾個小時內(nèi)形成，使管子形成分析成為胚胎發(fā)育、癌癥、傷口愈合和組織修復(fù)研究領(lǐng)域中血管生成定量的快速工具。

　　

　　

　　在µ-Slide 血管生成中的管形成測定期間，由 HUVEC 細(xì)胞組成的單鏈的相差(上圖)和熒光觀察（下圖）。F-肌動蛋白細(xì)胞骨架被染成綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。

　　

　　# 發(fā)芽試驗 #

　　

　　

　　類似于管形成試驗，發(fā)芽試驗也可用于量化體外血管生成。

　　

　　在這里，多細(xì)胞球體或組織塊（例如，來自主動脈）被置于凝膠基質(zhì)（例如，Matrigel ®、膠原蛋白）中或之上，然后它們在那里形成芽。

　　

　　為了進(jìn)行分析，在定義的時間點對細(xì)胞簇的發(fā)芽進(jìn)行成像，并測量發(fā)芽長度。發(fā)芽試驗與管形成試驗一樣，需要明確定義的凝膠層厚度，這在使用µ-Slide Angiogenesis和 µ-Plate Angiogenesis 96 Well時是標(biāo)準(zhǔn)化的 。

　　

　　# 血管新生和血管生成 #

　　

　　

　　開始實驗之前需要回答以下問題：

　　

　　1、哪種細(xì)胞密度最適合我的實驗？

　　

　　確定正確的細(xì)胞數(shù)量對于從管形成試驗中獲得最佳結(jié)果至關(guān)重要。細(xì)胞密度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞大小。在開始實際實驗之前，我們建議在非抑制條件下接種幾個細(xì)胞數(shù)并對管形成進(jìn)行成像。創(chuàng)建的管數(shù)最多的細(xì)胞密度將顯示出最明顯的物質(zhì)效應(yīng)，因此應(yīng)用于實驗。請記住，細(xì)胞通常不會在凝膠基質(zhì)上增殖。通常，我們建議每孔使用 5,000–10,000 個 HUVEC。

　　

　　2、我應(yīng)該使用哪種凝膠基質(zhì)？

　　

　　內(nèi)皮細(xì)胞的管形成率取決于形成基底膜樣細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 表面的凝膠的類型和成分，細(xì)胞在該表面上接種。幾種基底膜提取物可獲得，例如 Matrigel® 和 Cultrex®.，兩者均由 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 鼠肉瘤細(xì)胞分泌。在開始使用特定內(nèi)皮細(xì)胞類型進(jìn)行實驗之前，我們建議測試幾種基底膜物質(zhì)并遵循已發(fā)布的說明。如果將在您的分析中測試促血管生成劑，則應(yīng)使用減少生長因子的凝膠基質(zhì)。此外，如果可能，在整個實驗中使用相同的批次。

　　

　　3、實驗中應(yīng)包括哪些對照？

　　

　　為了對您的結(jié)果進(jìn)行正確的統(tǒng)計分析，包括陽性和陰性對照非常重要。作為陽性對照，在不使用任何抑制劑的情況下對您感興趣的細(xì)胞系進(jìn)行管形成試驗。當(dāng)在含有饑餓培養(yǎng)基的生長因子減少的 Matrigel® 上培養(yǎng)時，內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)在幾小時內(nèi)顯示出管的形成。作為陰性對照，可以使用不影響細(xì)胞活力的管形成抑制劑。

　　

　　4、我的移液器工作準(zhǔn)確嗎？它們是否經(jīng)常校準(zhǔn)？

　　

　　為避免在使用 µ-Slide 血管生成時凝膠基質(zhì)形成彎液面，將準(zhǔn)確數(shù)量的 10 µl 移入內(nèi)孔至關(guān)重要。此外，接種正確的細(xì)胞數(shù)非常重要。因此，有必要使用處于完美工作狀態(tài)的校準(zhǔn)移液器。我們建議用相應(yīng)的凝膠潤濕移液器吸頭，然后使用這個吸頭填充孔。

　　

　　5、我應(yīng)該在哪個時間段內(nèi)觀察細(xì)胞？

　　

　　管形成的持續(xù)時間取決于細(xì)胞類型和所使用的細(xì)胞外基質(zhì)，應(yīng)單獨(dú)確定。通常，HUVEC 在 2-4 小時后已經(jīng)形成管。24 小時后，細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，這會導(dǎo)致從基質(zhì)上脫離和管子破裂。

　　

　　

　　6、我應(yīng)該手動還是自動監(jiān)測管子的形成？

　　

　　如果有活細(xì)胞成像設(shè)備，我們建議使用延時視頻成像——尤其是當(dāng)您不熟悉所用細(xì)胞類型的血管生成行為時。在典型的設(shè)置中，在 24 小時的時間范圍內(nèi)每 5-15 分鐘自動拍攝一張照片。這使得能夠精確監(jiān)控管形成的進(jìn)程，例如，在添加特殊物質(zhì)之后。如果您已經(jīng)知道管形成的大致時間范圍，也可以在預(yù)期的感興趣時間點手動拍照。

　　

　　#ibidi血管生成載玻片原理 #

　　

　　1、樣品制備

　　

　　使用 µ-Slide 血管生成時，由于采用孔中嵌孔技術(shù)，凝膠基質(zhì)的量減少到每孔 10 µl。

　　

　　將凝膠基質(zhì)（例如 Matrigel ®、膠原凝膠或水凝膠）移入 µ-Slide 血管生成的下部孔中。培養(yǎng)直到凝膠聚合，然后將細(xì)胞接種到上孔中。接種后不久，細(xì)胞會下沉到凝膠表面，然后就可以進(jìn)行觀察了。

　　

　　

　　2、活細(xì)胞成像

　　

　　

　　3、數(shù)據(jù)分析

 

　　

　　圖像采集后，可分析管面積、管長、管數(shù)、環(huán)面積、環(huán)數(shù)、芽數(shù)等參數(shù)。這可以手動執(zhí)行，也可以使用自動化軟件執(zhí)行。參數(shù)的統(tǒng)計比較（單獨(dú)或組合）將概述不同條件下管形成的程度。