date:2024-08-23 13:40:04
血管形成實驗是一種簡單但功能強大的體外工具，用于篩選抗血管生成或促血管生成作用的物質。這些影響可以通過不同的參數來測量，例如管的長度或凝膠表面形成的環的數量。
初始步驟通常涉及創建一個基底膜狀凝膠基質作為生長區域(例如，通過使用Laminin-Collagen I或Matrigel®)。接下來，將細胞接種在固化的凝膠基質上，然后進行孵育并使用光學顯微鏡采集圖像數據。隨著時間的推移，測量管的形成參數提供了有價值的數據，可以揭示添加抗血管生成或促血管生成物質后管的形成特性的變化。
優化成管分析的實驗方案和數據采集方法對于獲得可靠和可重復的數據至關重要，這是正確分析的先決條件。本應用說明概述了重要的分析參數和規劃有效血管形成分析的指南。
1、規劃實驗
在開始管形成和血管生成分析之前，通過經驗測試確定較優的實驗設置至關重要。所選擇的系統應與研究目標密切一致，并允許可行的數據收集。因此，建立嚴格的方案對于生成可重復和可比較的數據集至關重要。
在管形成和血管生成實驗中，關鍵因素包括細胞類型、細胞密度、生長培養基、凝膠基質和數據采集時間點。這些因素將在接下來的章節中進一步討論。
在進行實驗之前，計算所需的材料，如培養基、凝膠基質、物質、實驗室器具和細胞數的數量。其他需要考慮的因素包括實驗室設備、空間要求和時間安排。每個實驗都應該在相同的細胞培養和環境參數下進行。
為了進行可靠的統計分析，我們建議每種情況至少有4個數據點，每種情況至少有8個單獨的孔。這導致總共至少32個單獨的實驗。實驗的次數取決于數據的同質性。在計算耗材、數據采集和數據處理時間時，應考慮這一點。
1.1 細胞類型和傳代次數
不同的細胞類型在大小、生長行為(擴散、加倍率)和對生長條件的要求上各不相同。例如，細胞大小決定細胞播種數以調整細胞密度。此外，生長培養基的成分可以影響促血管生成或抗血管生成作用。
此外，傳代次數(P)可以影響原代細胞的行為和功能，原代細胞通常用于管形成試驗。低傳代細胞(<P6)更具有生理相關性。然而，在較高的傳代中，細胞可能會經歷增殖能力的喪失，基因表達的改變和形態的改變，會影響結果。
一個成熟可靠的實驗設置是使用低傳代(<P6)的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，在不含生長因子和2%或更低血清的內皮細胞培養基中生長。
1.2 培養基成分
細胞培養基是管形成試驗中的一個重要因素，提供關鍵的營養物質并影響細胞行為。選擇優質培養基可確保細胞健康，并能準確反映生物過程。生長因子濃度和血清含量等因素在這一選擇中至關重要。
在培養基中加入血清可能會影響管的形成行為——在大多數情況下，血清會抑制管的形成。為了避免這個問題，在實驗前應使用1.3節中定義的優質細胞密度測試0-20%的不同血清濃度。這將決定管形成和細胞存活的優質血清濃度。
1.3 細胞密度
凝膠表面的細胞數量是獲得管形成試驗可靠結果的關鍵參數。要確定優質細胞播種密度，請記錄細胞系的特性。
首先，在 5–40 × 103個細胞/ml的范圍內進行稀釋。然后將細胞接種到凝膠表面。接種后，開始以30分鐘的時間間隔記錄相位對比圖像。理想情況下，每個細胞濃度執行3-5次重復。
按照第3節的描述對圖像進行評估。在這里，我們建議使用較常見的關鍵參數“總管長”。在您選擇的一個時間點(例如，4小時后)，在下圖中可視化細胞播種密度與管長度的關系。數據將顯示一個具有較大值的特征曲線，這是所使用細胞類型的優質播種密度。。此處所示的示例使用HUVEC，其優質播種密度為 10–20 × 103個細胞/ml。
HUVEC播種密度響應的示例性。該圖顯示了在播種后4小時隨細胞播種密度變化的分析管長。
1.4 陽性和陰性對照
在管生成實驗中，結合控制對于獲得有意義、可靠的結果至關重要。
應使用刺激管形成的陽性對照來建立對生物活性物質反應的參考值。為了建立陽性對照，選擇一個確保管形成的實驗環境(例如，用于HUVECs的Matrigel®低生長因子和無血清培養基)。陽性對照驗證細胞的生命狀況，并作為任何促血管生成或抗血管生成物質的參考。陰性對照確保在細胞培養實驗中可以抑制管的形成。為了建立陰性對照，選擇一種被證明對管狀形成有抑制作用的物質(例如，用于HUVECs的蘇拉明)。
1.5 凝膠基質
用于管形成測定的凝膠用作基底膜樣（BM）表面，以模擬體外的自然條件。然而，凝膠的生化和機械性能顯著影響細胞行為，并影響管的形成。
用于管形成分析的先進凝膠是Matrigel®或Laminin膠原蛋白I凝膠。兩種凝膠都有各自的優點和缺點，在規劃實驗時應該考慮到這一點。
Matrigel®是一種從Engelbreth Holm Swarm小鼠肉瘤中提取的天然即用型BM溶液。然而，一個缺點是癌癥環境中生長因子的定義不清且成分可變。這導致不同批次之間的機械和生化性能波動，從而改變管的形成特性。因此，當使用Matrigel®時，所有實驗都應使用同一批次的Matrigel®進行。
相比之下，雙組分層粘連蛋白-膠原I凝膠被認為具有更明確的基質組成。但是，它并不包括BM的所有天然成分。
2、成像
成像在管形成分析中起著關鍵作用，因為它可以詳細觀察和分析血管生成效應。通常，相差顯微鏡用于可視化細胞動力學，而不需要染色。管形成分析即可以作為時間序列進行，以確定形成的動態行為，也可以作為終點實驗，在一定時間后固定細胞進行成像。
2.1 選擇優質的物鏡
由于管的形成是在整個載玻片孔的表面區域，因此建議觀察盡可能大的視場角(FOV)建議，以獲得較大的信息量。FOV可以通過改變物鏡的放大倍數來改變——使用4x到10x物鏡的低放大倍率對于大多數管形成實驗來說是足夠的。
Tips：視場(FOV)與圖像分辨率間接相關。使用低倍率物鏡（2-10倍）將導致低分辨率的大視場。相比之下，使用高倍率物鏡(20倍或更高)將導致較低的視場，但具有較高的分辨率。
如果需要高分辨率的大視場，建議采集后對單幅圖像進行拼接掃描。
2.2 延時成像對于延時成像和活細胞成像，需要維持一個穩定的生理環境，以確保細胞的自然行為，使用ibidi Stage Top Incubators可以實現這一點。在凝膠表面播種細胞后，立即將載玻片或培養皿置于顯微鏡上適當的孵育室中，并開始時間序列。可能需要對每個時間步驟進行焦點調整，這可以手動或使用基于軟件的工具完成。
如果您的顯微鏡沒有孵育室，請在獲取圖像后立即將樣品放入細胞培養箱中。在這種情況下，盡量縮短成像時間（例如，盡量縮短培養箱和顯微鏡之間的距離），以避免樣品中的溫度波動。
在進行延時成像時，時間間隔和總成像時間取決于所使用的細胞系和實驗條件。例如，第一種方法可能是在24小時內以15-30分鐘的時間步長進行成像。然后，應該調整第一次實驗的時間序列參數，以找到較優的時間步長。因此，通過可視化一個關鍵參數(例如，管總長度，見第3節)與時間的關系來分析時間序列，如下圖所示。該參數的時間曲線與細胞有關，這里展示了在Matrigel®上生長的HUVEC細胞的示例。在這里，時間曲線通常上升到緩慢平坦(>20小時)。應定義一個信號高且穩定的時間點進行分析。在下面的例子中，當使用在Matrigel®上生長的HUVEC細胞時，建議的測量時間點在4到5小時之間。
在Matrigel®上以15分鐘的時間間隔生長超過24小時的HUVEC細胞的時間序列。這里，從每個時間步長計算出作為管形成代表參數的總管長度。該參數的曲線通常會上升到較大值（此處為~4小時），然后下降到平穩階段（此處為~7小時后），逐漸緩慢變平（此處為>20小時）。
3、管形成和血管生成分析的輸出參數
“管”一詞描述的是在二維網狀系統中可見的細胞索。具體來說，這并不意味著細胞索有管腔。在管形成分析中，可以從相位對比圖像中確定四個關鍵參數，如下圖所示。
• 細胞覆蓋面積[%] (藍色區域)
• 管長 [px] (紅線)
• 分支點數 (白點)
• 環路數 (黃色數字)
這些關鍵參數在實驗過程中顯示出相互一致的關系。因此，只需確定一個特征就足夠了：在本應用說明中，將只使用管的長度作為管形成的代表性值。
相位圖像（A）和分析圖像（B）顯示了管形成分析的關鍵特征：細胞覆蓋面積（藍色）、管（紅色）、環路（黃色）和分支點（白色）。
根據這些參數，可以計算出其它值，如平均管長、總管長和環的平均面積。
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